Kitapo QuantScript RT

A-1 RNA dia simba

——Ataovy madio ny RNA tsy misy loto. Ny fitaovana nalaina avy amin'ny RNA dia tokony ho vao haingana araka izay azo atao mba hisorohana ny fahasimban'ny RNA. Fakafakao ny fahamendrehan'ny RNA amin'ny gel voatanisa alohan'ny fihetsiky ny RT. Aorian'ny fitrandrahana RNA dia tokony hotehirizina ao anaty formamide 100% izy io. Raha RNase inhibitor no ampiasaina, ny hafanan'ny hafanana dia tokony <45 ° C, ary ny pH dia tokony ho latsaky ny 8.0, raha tsy izany dia hamotsotra ny RNase voafatotra rehetra ny mpanakana. Ankoatr'izay, ny RNase inhibitor dia tokony ampiana amin'ny vahaolana misy ≥ 0.8 mM DTT.

A-2 RNA dia misy mpanakana ny fanehoan-kevitra momba ny fandikana

—— Ireo mpanakan-dàlana hafa dia misy SDS, EDTA, glycerol, sodium pyrophosphate, spermidine, formamide, salt guanidine, sns afangaro ny santionany RNA amin'ny santionany, ary ampitahao ny vokatra amin'ny valin'ny RNA fanaraha-maso hijerena raha misy mpanakana. Sasao ny rotsak'orana RNA miaraka amin'ny etanol 70% (v / v) hanalana ireo mpanakana.

A-3 Tsy ampy ny fanindronana primera ampiasaina amin'ny famolavolana ny kofehin'ny cDNA voalohany

——Famariho fa ny mari-pana mampifandray dia mety amin'ny primera ampiasaina amin'ny andrana. Ho an'ny hexamers kisendrasendra dia asaina hitazona ny mari-pana amin'ny 25 ° C mandritra ny 10 min alohan'ny hahatongavan'ny hafanan'ny fihetsika. Ho an'ireo primera manokana momba ny fototarazo (GSP), andramo ny GSP hafa, na mifamadiho amin'ny oligo (dT) na hexamer kisendrasendra.

A-4 Vitsy manomboka RNA

—— Ampitomboy ny habetsaky ny RNA. Ho an'ny santionan'ny RNA latsaky ny 50 ng, 0,1 μg ka hatramin'ny 0,5 μg acetyl BSA dia azo ampiasaina amin'ny synthes cDNA voalohany.

A-5 Ny filaharana kendrena dia tsy aseho amin'ireo sela voadinika.

—— Andramo ireo sela hafa.

Tsy nahomby ny fanehoan-kevitra A-6 PCR

—— Ho an'ny RT-PCR dingana roa, ny modely cDNA ao amin'ny dingana PCR dia tsy afaka mihoatra ny 1/5 amin'ny habetsaky ny fanehoan-kevitra.

A-1 Fanangonana an-tsoratra primera tsy voafaritra manokana

——Tsy tokony hisy 2-3 dG na dC ny faran'ny primera 3'-d. Mampiasà primera manokana momba ny Gene ao amin'ny synthesis strand voalohany fa tsy primer kisendrasendra na oligo (dT). Ampiasao ny mari-pana annealing ambony kokoa amin'ny tsingerina vitsivitsy voalohany, ary avy eo ny mari-pana fampidirana annealing ambany. Mampiasà polymerase Taq ADN mafana ho an'ny PCR hanatsarana ny famaritana ny fihetsika.

A-2 Famolavolana ratsy ny primer manokana momba ny génera

—— Araho ireo fitsipika mitovy amin'ny famolavolana volavolan-dalàna voalohany.

A-3 RNA voaloton'ny ADN genomika

——Rangahy RNA miaraka amin'ny PCR-grade DNase I. Mametraha réaction a réaction raha tsy misy transcription miverin-dàlana hahitana ny fahalotoan'ny ADN.

A-4 Famoronana primer dimer

—— Drafitra primer tsy misy filaharana mifameno amin'ny faran'ny 3 '.

A-5 Avo loatra Mg²⁺ fitanana

—— Manatsara ny Mg²⁺ fifantohana isaky ny maodely sy ny fitambaran'ny primer

A-6 voaloto amin'ny ADN avy any ivelany

——Mampiasà toro-hevitra mahatohitra aerosol sy anzima UDG.

A-1 Avo loatra ny atin'ny vokatra strand voalohany

——Mampihena ny isan'ny vokatra strand voalohany amin'ny dingana fanehoan-kevitra PCR mahazatra.

A-2 Be loatra ny volan'ny primer amin'ny fanehoan-kevitra PCR

——Mampihena ny fidiran'ny primer.

A-3 Kitapo be loatra

——Tombohy ny toe-tsain'ny PCR ary ahena ny isan'ny tsingerin'ny PCR.

A-4 Tena ambany ny mari-pana momba ny annealing

——Mampiakatra ny mari-pana mampiditra mba tsy hisian'ny fanombohana sy fanitarana tsy voafaritra manokana.

A-5 Fanamafisana tsy voafaritra ny sombintsombin'ny oligonucleotide nateraky ny fahasimban'ny DNase ny ADN ——Aoka ny RNA avo lenta mba hisorohana ny fandotoan'ny ADN.

Ny RT-PCR dia ny famerenana ny fandikana ny RNA ho cDNA, ary avy eo dia ampiasao ny cDNA voadika amin'ny endriny ho modely ho an'ny fanehoan-kevitr'i PCR hanamafisana ny sombiny kendrena. Misafidiana primer kisendrasendra, oligo dT ary genes manokana momba ny génera arakaraka ny fepetra voafaritra amin'ny andrana. Ny primer etsy ambony rehetra dia azo ampiasaina amin'ny sela mRNA eukaryotic fohy tsy misy firafitra volo.

Random primer: Mety amin'ny RNA lava misy firafitra volo, ary koa ny karazana RNA rehetra toy ny rRNA, mRNA, tRNA, sns. Ampiasaina matetika amin'ny valin'ny RT-PCR amin'ny modely tokana.

Oligo dT: Mety amin'ny RNA misy taolana PolyA (prokaryotic RNA, eukaryotic Oligo dT rRNA ary tRNA dia tsy manana rambony PolyA). Satria i Oligo dT dia voafatotra amin'ny rambony PolyA, ny kalitaon'ny santionan'ny RNA dia takiana ho avo, ary na dia ny fahasimbana kely aza dia hampihena be ny habetsaky ny synthesie cDNA lava.

Primer manokana momba ny Gene: Mameno ny filaharana modely, mety amin'ny toe-javatra izay fantatra ny filaharan'ny kendrena.

Misy fomba roa:

1. Fomba fanovozan-kevitra anatiny: Amin'ny teôria, ny cDNA dia sombina ADN amin'ny halava samy hafa, noho izany ny vokatry ny electrophoresis dia smear. Raha ambany ny haben'ny RNA dia tsy misy vokatra haseho amin'ny electrophoresis, fa tsy midika izany fa tsy misy vokatra hohamafisin'ny PCR. Amin'ny ankapobeny, ny referansa anatiny dia azo ampiasaina hamantarana cDNA. Raha misy valiny ny fanovozan-kevitra anatiny dia azo antoka ny kalitaon'ny cDNA (amin'ny tranga vitsivitsy, raha lava loatra ny sombin-java-kendrena, dia mety hisy faningana).

2. Raha misy gèena fantatra nohamafisin'ity modely ity dia azo hamarinina amin'ny alalàn'ity fototarazo ity. Ny fanamafisana ny referansa anatiny dia tsy midika hoe tsy misy olana amin'ny cDNA. Satria ny référence anatiny dia be dia be amin'ny cDNA, mora ny manamafy. Raha simbaina amin'ny ampahany ny cDNA noho ny antony maro samihafa, amin'ny fomba fijerin'ny mety, ny vokatry ny PCR amin'ny génie kendrena ambany dia voadona mafy. Na dia betsaka aza ny referansa anatiny, dia mety tsy ho voakasik'izany ny fanamafisana.

Fanimbana ampahany amin'ny RNA. Tadiavo ny fahamendrehana ary diovy ny RNA

Ny atin'ny RNA amin'ny karazany samy hafa dia mety ho samy hafa, fa amin'ny ankapobeny, ny totalin'ny RNA nesorina dia tokony hanana fantsona 28S sy 18S mazava amin'ny gel electrophoresis, ary ny famirapiratan'ny tarika teo aloha dia tokony ho avo roa heny noho ny an'ny farany. Ny tarika 5S dia manondro fa nihombo ny RNA, ary ny famirapiratany dia mifanaraka amin'ny ambaratongan'ny fahasimbana. Ny fanamafisana mahomby ny fanovozan-kevitra anatiny dia tsy midika hoe tsy misy olana amin'ny RNA, satria ny referansa anatiny dia be dia be, ny RNA dia azo hohamafisina raha mbola tsy mafy ny fahasimbana. Ny OD₂₆₀/ OD₂₈₀ny tahan'ny RNA madio refesina amin'ny spectrophotometer dia tokony ho eo anelanelan'ny 1,9 sy 2,1. Ny fahalotoana proteinina kely ao amin'ny RNA dia hampihena ny tahan'ny. Raha mbola tsy ambany dia ambany ny sandany dia tsy ho voakasik'izany ny RT. Ny tena zava-dehibe amin'ny RT dia ny tsy fivadihan'ny RNA.

Ny fanitarana ny fototarazo anatiny dia mety hanondro fa nahomby ny RT, saingy tsy voatery mifandray amin'ny kalitaon'ny kofehy cDNA. Satria ireo sombin-tsoratra ao anatiny amin'ny ankapobeny dia kely ny habeny ary avo ny endriny, dia mora kokoa ny hahomby amin'ny fandikana an-tsoratra. Na izany aza, ny habe sy ny fanehoana ny génère target dia samy hafa isan-karazany. Ny kalitaon'ny cDNA dia tsy azo tsaraina amin'ny alàlan'ny fanondroana anatiny fotsiny indrindra fa ireo sombiny kendrena lava kokoa noho ny 2 kb.

Ny santionany sasany dia manana firafitra ambaratonga faharoa sarotra, na manana atiny GC manankarena, na sarobidy miaraka amin'ny haben'ny ambany. Amin'ireto tranga ireto dia tokony hifantina ny transcriptase mifanohitra mifanentana arakaraka ny haben'ny sombin-javatra kendrena sy ny santionany. Ho an'ny modely RNA miaraka amin'ny atiny GC ambony sy ny rafitra faharoa dia sarotra ny manokatra ny rafitra faharoa amin'ny hafanana ambany, na amin'ny transcriptase mahazatra. Ho an'ireo modely ireo, Quant Reverse Transcriptase dia azo fidina, satria ny fahombiazan'ny fandikana an-tsoratra dia mazava ho tsara kokoa noho ny an'ny M-MLV series transcriptase miverimberina, izay afaka mamadika ny fandefasana modely RNA isan-karazany amin'ny fomba mahomby ary mamadika ny RNA ho any amin'ny cDNA voalohany amin'ny fatra farany ambony. Rehefa mampiasa kit transcriptase ankapobeny miverimberina, ny rafitra 20 μl dia afaka mamadika amin'ny fomba mahomby ny 1 μg an'ny RNA tanteraka. Azafady mba diniho tsara ny fahaizan'ny RT faran'ny kit. Raha ampiana be loatra ny môdely, ny transcript mifamadika dia hankasitraka ny RNA be dia be. Noho izany, tsara kokoa ny tsy mihoatra ny fahaizan'ny rafitra farany ambony.

A-1 Fantaro raha simbaina mafy ny RNA ary raha mahomby ny RT

Amin'ny ankapobeny, ny antony tsy fahombiazan'ny fanamafisam-peo anatiny dia matetika vokatry ny fahasimban'ny RNA matotra. Antony iray hafa mety hitranga satria ny tsy fahombiazan'ny fandikana an-tsoratra. Ny referansa anatiny dia tsy azo ampiasaina ho fenitra hitsarana ny kalitaon'ny tady tokana cDNA, saingy azo ampiasaina ho fenitra hitsarana raha mahomby ny fandikana an-tsoratra raha tsy misy olana amin'ny kalitaon'ny RNA. Ny zava-dehibe indrindra amin'ny fizotran'ny transcription dia ny hitazonana ny mari-pana tsy miova sy ny rafitra fanehoan-kevitra tsy miova mba hanatsarana ny fahombiazan'ny fanehoan-kevitra.

A-2 Fantaro raha azo antoka ny primera amin'ny fanamafisana ny fototarazo anatiny ary raha misy ny olana amin'ny reagents ampiasaina amin'ny PCR.

Ho an'ny famaritana somary voafaritra, ny RNA dia tsy maintsy refesina alohan'ny fandikana an-tsoratra, izay takiana ihany koa amin'ny kitapo famadihana miverimberina, ohatra, hamaritana ny fidiran'ny RNA ho 1 μg. Koa satria ny cDNA voadika amin'ny endriny hafa dia vahaolana mifangaro, ao anatin'izany ny RNA, oligo dT, anzima, dNTP, ary na dia residue ADN kely aza, dia hiteraka fihenan-tany, ka tsy azo atao ny manisa tsara ny cDNA. Noho izany, ilaina ny fanisana RNA. Ny fiheverana ny fahombiazan'ny fandikana an-tsoratra dia mitovy amin'ny santionany isan-karazany, ny habetsaky ny cDNA azo dia tokony hitovy, ary ny famakafakana isa dia afaka mampiseho ny fampitahana ny haavon'ny fitenenana ny gène samy hafa amin'ny habetsaky ny totalin'ny RNA. Rehefa manao PCR habetsaky ny fluoresensialy dia mety tsy ilaina ny cDNA miverina rehefa averina ny fandikana satria ny génnn referansa anatiny dia azo asiana referansa.

Izy io dia mifandraika indrindra amin'ny fototarazo, ary ny fandikana ny sombiny lava dia tsy azo atao amin'ny ankamaroan'ny fototarazo. Voalohany, ny fahombiazan'ny transcription miverina dia ambany lavitra noho ny an'ny PCR. Faharoa, ny faritra manankarena GC sy ny firafitra faharoa amin'ny fototarazo maro dia mametra ny fandikana an-tsoratra sy ny PCR. Farany, ny fahamendrehana sy ny fahombiazan'ny PCR dia sarotra antoka mandritra ny fotoana iray. Amin'ny dingan'ny fandikana an-tsokosoko dia tsy misy afaka manome toky fa hahazo sombina lava ho an'ny fototarazo ambany, indrindra ny fampiasana oligo dT. Raha ny 5 'UTR miaraka amina GC bebe kokoa, mbola sarotra kokoa aza. Noho izany dia mbola fomba mety ihany ny famadihana transcript misy primer kisendrasendra, mahita ireo tranokala voajanahary voajanahary ao amin'ny sombin-javatra kendrena, manitatra isaky ny segondra, ary avy eo manao ny famerana sy ny ligation famerana. Amin'ny ankapobeny dia sarotra ny manamafy mivantana ireo sombiny lehibe kokoa noho ny 2 kb, saingy tsy azo atao foana ny mahazo: 1. Voalohany indrindra, manome toky ny tsy fivadihan'ny RNA / mRNA, ary ny fitrandrahana TRIZOL no aleony. 2.M-MLV kit RT-PCR azo ampiasaina mivantana. Halaviro ny fotoana annealing ary ampitomboy araka ny tokony ho izy ny tsingerin'ny cycle. Raha tsy izany, ny PCR misy akany dia azo ampiharina, na manatanteraka fanehoan-kevitra iray na roa aloha amin'ny denaturation lava sy fotoana fanitarana alohan'ny fanamafisana PCR mahazatra, izay mety hanampy amin'ny fanitarana sombin-javatra. Tandremo ny tsy fivadihan'ny polymerase. 3.Long Taq dia azo ampiasaina amin'ny PCR hahazoana vokatra tsara. 4. Ho an'ny fampiharana proteinina, tokony hampiharina ny polymerase mahatoky avo.

Misy karazany roa ny transcriptase mivadika natolotry ny TIANGEN: Quant / King RTase ary TIANScript M-MLV. Ny tena maha samy hafa azy ireo dia ny habetsahan'ny modely ampidirina. Quant dia transcriptase mihodina tsy manam-paharoa, izay tsy mitovy amin'ny M-MLV mahazatra ampiasaina avy amin'ny virus virus leukemia Moloney murine. Quant dia transcriptase miverimberina avo lenta avo lenta izay nasehon'ny injeniera Escherichia coli. Quant dia mety amin'ny fanamafisana 50 ng-2 μg an'ny RNA miaraka amin'ny hetsika transcriptional avo lenta sy vokatra avo. Raha ampitahaina amin'ny MMLV tsotra na AMV, ny toetra mampiavaka an'i Quant dia ny fananana firaiketam-po mahery vaika amin'ny modely RNA ary afaka mamadika modely sarotra amin'ny transcript tsy misy dematuration amin'ny mari-pana ambony. Ho an'ny modely misy atiny GC avo kokoa, avo kokoa ny fahombiazan'ny fivadika. Na izany aza, ity transcriptase mivadika ity dia misy hetsika RNase H, izay mety hisy fiantraikany amin'ny halavan'ny vokatra cDNA (mety amin'ny modely <4.5 kb). Ho an'ny fandikana mahazatra mahazatra, TIANScript MMLV mivadika transcriptase no soso-kevitra. Ity RTase ity dia anzima novaina miaraka amina hetsika RNase H tena malemy, izay mety amin'ny synthesis cDNA lava (> 5 kb).

Ny transcription iray dingana ary ny fanamafisana PCR dia vita ao anaty fantsona iray ihany nefa tsy manokatra ny fonosana fantsona eo anelanelan'ny synthes cDNA sy ny fanamafisana, izay manampy amin'ny fampihenana ny fandotoana. Satria ny santionan'ny cDNA rehetra azo ampiasaina amin'ny fanamafisana, ny fahatsapana dia avo kokoa, miaraka amin'ny 0,01 pg farafahakelin'ny RNA manontolo. Ho an'ny RTPCR dingana iray mahomby, ny primera manokana momba ny fototarazo dia matetika ampiasaina hanombohana ny synthesie cDNA. Ny fomba dingana roa, izany hoe ny transcription mifamadika sy ny fanamafisana PCR dia tanterahina amin'ny dingana roa. Ny fandikana aloha dia natao avy amina modely RNA hahazoana cDNA, ary ny cDNA azo dia iharan'ny fanehoan-kevitra PCR iray na maromaro. Ny fomba roa-dingana dia afaka mampiasa oligo (dT) na primer kisendrasendra mba hitarika ny fitambaran'ny kofehy voalohany an'ny cDNA, ary afaka mamadika ny fandefasana vaovao mRNA rehetra amin'ny santionany manokana.