TIANSeq Adapter tokana-tokana (Illumina)

Amin'izao fotoana izao, ny haitao avo lenta avo lenta dia miankina indrindra amin'ny haitao manaraka. Satria voafetra ny halavan'ny famakiana ny haitao manaraka, dia tsy maintsy arotsantsika ho tranombokin'ny sombin-javatra kely ny filaharana. Araka ny filan'ny andrana samihafa, dia matetika isika no mifantina ny laharana farany na ny fizarana misy indroa. Amin'izao fotoana izao ny sombintsombin'ny ADN an'ny famakiam-boky manaraka dia zaraina amin'ny 200-800 bp.

a) Ratsy kalitao ny ADN ary misy mpanakana. Mampiasà santionany ADN avo lenta mba hialana amin'ny fanakanana ny hetsika anzima.

b) Ny habetsahan'ny santionan'ny ADN dia tsy ampy rehefa mampiasa fomba tsy misy PCR hananganana tranomboky ADN. Rehefa mihoatra ny 50 ng ny fidiran'ny ADN misy sombintsombiny dia azo tanterahina amin'ny fomba mifantina mandritra ny fizotry ny fananganana tranomboky ny fikorianana tsy misy PCR. Raha ambany loatra ny nomeraon'ny kopian'ny trano famakiam-boky ka tsy azo atao filaharana mivantana, ny tranomboky ADN dia afaka manamafy ny PCR aorian'ny filasiana adapter.

c) Ny fahalotoan'ny RNA dia mitarika ho amin'ny fikajiana ADN voalohany tsy mety, ny fandotoana RNA dia mety misy amin'ny dingan'ny fanadiovana ny ADN genomika, izay mety hiteraka tsy fitoviana ADN ary tsy ampy ny famoahana ADN mandritra ny fananganana tranomboky. RNA dia afaka esorina amin'ny fitsaboana amin'ny RNase.

A-1

a) Sombiny madinidinika (60 bp-120 bp) dia mipoitra sombina kely matetika sombina adaptatera na dimers namboarin'ny adaptatera. Ny fanamasinana amin'ny vatan'ny magnetika Agencourt AMPure XP dia afaka manala ireo sombin-tsolika adapter ireo ary miantoka ny kalitaon'ny filaharana.

b) Sombin-javatra lehibe miseho ao amin'ny trano famakiam-boky aorian'ny fanamafisana PCR Ny haben'ny sombin'ny ADN fitehirizam-boky dia hitombo 120 bp aorian'ny fampiraisana ny adaptatera. Raha toa ka mitombo mihoatra ny 120 bp ny sombin'ny ADN aorian'ny fanamafisana ny adapter, dia mety ho vokatry ny fanamafisana ny sombintsombin'ny fanamafisana PCR be loatra. Ny fihenan'ny isan'ireo tsingerin'ny PCR dia afaka misoroka ny toe-javatra.

c) Ny haben'ny sombin'ny ADN famakiam-boky aorian'ny fametahana adapter Ny halavan'ny adaptatera ao amin'ity kit ity dia 60 bp. Rehefa mifamatotra amin'ireo adaptatera ny tendrony roa amin'ilay sombin-javatra dia hitombo 120 bp fotsiny ny halavany. Rehefa mampiasa adaptatera hafa noho izay omen'ity kitapo ity dia mifandraisa amin'ny mpamatsy mba hanome fampahalalana mifandraika toy ny halavan'ny adapter. Azafady mba alao antoka fa ny dingan-dàlan'ny fanandramana sy ny fandidiana dia manaraka ireo dingana voalaza ao amin'ny boky.

d) haben'ny sombintsombin'ny ADN tsy ara-dalàna alohan'ny fisidinan'ny adapter Ny antony mahatonga an'io olana io dia mety vokatry ny toe-piainana diso mandritra ny fivakisan'ny ADN. Ny fotoana fanehoan-kevitra samihafa dia tokony hampiasaina amin'ny fampidirana ADN samihafa. Raha mihoatra ny 10 ng ny fidiran'ny ADN dia nanoro hevitra izahay ny hisafidy ny ora fihenam-bidy 12 mn ho fotoana hanombohana ny fanatsarana, ary ny haben'ny sombina novokarina amin'izao fotoana izao dia eo amin'ny 300-500 bp. Ireo mpampiasa dia afaka mampitombo na mampihena ny halavan'ny sombintsombin'ny ADN mandritra ny 2-4 min arakaraka ny zavatra takian'izy ireo manokana hanatsarana ireo sombin'ny ADN miaraka amin'ny habe takiana.

A-2

a) Ny fotoana fanaparitahana dia tsy nohamarinina Raha kely loatra na lehibe loatra ny ADN misy sombintsombiny, azafady mba jereo ny Torolàlana momba ny fisafidianana ny fotoana manaparitaka izay omena ao amin'ny torolàlana hamaritana ny ora anaovana ny fihetsika, ary ampiasao ity teboka ity ho toy ny fanaraha-maso, koa manangana rafitra fanehoan-kevitra hanalava na hanafohezana 3 min hanaovana fanitsiana marina kokoa amin'ny fotoana sombintsombiny.

A-3

Fitsinjarana habe tsy ara-dalàna ny ADN aorian'ny fitsaboana fizarazarana

a) Fomba fanalefahana diso amin'ny réagment fragmentation, na ny reagent dia tsy afangaro tanteraka aorian'ny fanalefahana. Fangaro ny rezimanta 5 × Fragmentation Enzyme amin'ny ranomandry. Raha vao maty, afangaro tsy miova ny reagent amin'ny alàlan'ny fanidinana moramora ny faran'ny fantsona. Aza vortex ny reagent!

b) Ny santionany fampidiran'ny ADN dia misy EDTA na fandotoana hafa fandotoana ny ion-tsiranoka sy mpiasan'ny chelating amin'ny dingana fanadiovana ADN izay zava-dehibe indrindra amin'ny fahombiazan'ny andrana. Raha levona ao anaty 1 × TE ny ADN dia ampiasao ny fomba omena ao amin'ny torolàlana mba hanaovana fragmentation. Raha tsy azo antoka ny fifantohana EDTA amin'ny vahaolana dia ilaina ny manadio ny ADN ary mamoaka azy ao anaty rano deionisa ho an'ny fanehoan-kevitra manaraka.

c) Fikajiana ADN voalohany tsy marina Ny haben'ny ADN voaparitaka dia mifandray akaiky amin'ny habetsahan'ny fidiran'ny ADN. Alohan'ny fitsaboana fragmentation, ny famaritana marina ny ADN amin'ny alàlan'ny Qubit, Picogreen ary fomba hafa dia ilaina mba hamaritana ny habetsaky ny ADN ao amin'ny rafitra fanehoan-kevitra.

 d) Ny fanomanana ny rafitry ny fanehoan-kevitra dia tsy manaraka ny torolàlana. Mba hiantohana ny vokatra tsara indrindra dia tokony apetraka amin'ny ranomandry ny singa fanehoan-kevitra rehetra ary ny fanomanana ny rafitry ny fanehoan-kevitra dia tokony hatao aorian'ny fampangatsiahana tanteraka. Rehefa vita ny fanomanana dia tsindrio azafady na pipet mba afangaro tsara. Aza vortex!

1. Ny fomba fampifangaroana tsy mety (vortex, oscillation mahery setra, sns.) Dia hiteraka fizarana tsy ara-dalàna ny sombin-tsoratry ny tranomboky (araka ny aseho amin'ity sary manaraka ity), ka misy fiatraikany amin'ny kalitaon'ny tranomboky. Noho izany, rehefa manamboatra ny vahaolana fanehoan-kevitra Fragmentation Mix dia miangavy ianao mba paompy moramora miakatra sy midina mba afangaro, na ampiasao ny tendron'ny rantsan-tànana hikapohana sy hifangaroana mitovy. Tandremo sao mifangaro amin'ny vortex.

2. Ny ADN momba ny fahadiovana avo lenta dia tsy maintsy ampiasaina amin'ny fananganana tranomboky

■ fahamendrehana ADN tsara: mihoatra ny 30 kb ny tarika electrophoresis, tsy misy rambony

■ OD260 / 230:> 1.5

■ OD260 / 280: 1.7-1.9

3. Ny habetsahan'ny fidiran'ny ADN dia tokony ho marin-kevitra.

4. Ny atin'ny EDTA amin'ny vahaolana ADN dia tsy maintsy faritana fa ny EDTA dia misy fiatraikany lehibe amin'ny fiovan'ny fragmentation. Raha avo ny atin'ny EDTA dia mila atao ny fanadiovana ADN alohan'ny fitsapana manaraka.

5. Ny vahaolana valin'ny fizarazarana dia tsy maintsy omanina amin'ny ranomandry. Mba hiantohana ny maha-marina ny fotoana anaovan'ny fanehoan-kevitra, dia miomàna azafady mba hiomanana amin'ny rafitra ranomandry ny reaction.

6. Ny fotoana fiovan'ny sombin-javatra dia tokony ho marina Ny fotoana fihetsiky ny fizarana sombin-javatra dia misy fiantraikany mivantana amin'ny haben'ny vokatra sombina, ka misy fiatraikany amin'ny haben'ny fizarana sombin'ny ADN ao amin'ny tranomboky.

1. Inona ny karazana santionany azo ampiharina amin'ity kitapo ity?

Ny karazana santionany azo ampiharina amin'ity kit ity dia mety ho RNA tanteraka na mRNA voadio miaraka amin'ny fahamendrehana RNA tsara. Raha RNA tanteraka no ampiasaina hanamboarana ny fitehirizam-boky dia asaina mampiasa ny kitapo fanalefahana rRNA (Cat # 4992363/4992364/4992391) hanesorana ny RRNA aloha.

2. Azo ampiasaina ve ny santionany FFPE hanamboarana tranomboky miaraka amin'ity kitapo ity?

Ny mRNA ao amin'ny santionan'ny FFPE dia ho simba amin'ny lafiny iray, miaraka amin'ny tsy fahampian'ny tsy fivadihana. Rehefa mampiasa ity kit ho an'ny fananganana tranomboky ity, dia asaina manatsara ny fotoana fivakisana (hanafohezana ny fotoana fivakisana na ny tsy fananganana).

3. Amin'ny fampiasana ny dingana mifantina ny habeny omena ao amin'ny boky torolàlana momba ny vokatra, inona no mety hitranga amin'ny fisintahana somary latsaka kely?

Ny fisafidianana ny habe dia ho tanterahina mifanaraka amin'ny dingana mifantina ny habeny amin'ity boky torolàlana ity. Raha misy ny fiviliana, ny antony dia mety tsy voalanjalanja amin'ny maripanan'ny efitrano na tsy mifangaro tanteraka ireo vakana andriamby, ny pipeta dia tsy marina na ny ranona tavela amin'ny tendrony. Amporisihina hampiasa ny torohevitra misy adsorption ambany ho an'ny fanandramana.

4. Fisafidianana adaptatera amin'ny fananganana tranomboky

Ny kit ny fananganana trano famakiam-boky dia tsy misy reagent adaptatera ary ampirisihina hampiasa an'ity kitapo ity miaraka amin'ny TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC an'ny tranomboky

Famaritana habetsahan'ny trano famakiam-boky: Qubit sy qPCR dia ampiasaina hamaritana ny fatran'ny masomboly sy ny molar ao amin'ny tranomboky. Ny fandidiana dia mifanaraka tanteraka amin'ny boky torolàlana momba ny vokatra. Ny fitanana ny tranomboky amin'ny ankapobeny dia mahafeno ny fepetra takiana amin'ny filaharana NGS. Famantarana ny fizarana fizarana trano famakiam-boky: Ampiasao ny Agilent 2100 Bioanalyzer hahitana ny faritra fizarana trano famakiam-boky.

6. Fisafidianana ny isa fanamafisam-peo

Araka ny torolalana, ny isan'ireo tsingerina PCR dia 6-12, ary ny isan'ireo tsingerina PCR ilaina dia tokony hofidina arakaraky ny santionany. Ao amin'ny trano famakiam-bokatra avo lenta, ny fanamafisana dia matetika miseho amin'ny ambaratonga samihafa, izay aseho amin'ny tampon'isa somary lehibe kokoa aorian'ny tampon'ilay tanjona kendrena amin'ny fitadiavana ny Agilent 2100 Bioanalyzer, na ny fitanana Qubit hita fa ambany kokoa noho ny qPCR. Ny malemy noho ny fanamafisana dia tranga mahazatra, izay tsy misy fiatraikany amin'ny filaharan'ny tranomboky sy ny fanadihadiana ny angona manaraka.

7. Ny spikes dia mipoitra ao amin'ny piraofilin'ny maso Agilent 2100 Bioanalyzer

Ny fisehoan'ny tsimatra amin'ny detection Agilent 2100 Bioanalyzer dia noho ny sombin-javatra tsy mitovy amin'ny sample, izay hisy sombina bebe kokoa amin'ny habe sasany, ary hiharihary kokoa izany aorian'ny fampiroboroboana PCR. Amin'ity tranga ity dia soso-kevitra tsy hanao ny fisafidianana ny habeny, izany hoe apetraho amin'ny 94 ° C ny mari-pahatapahana mandritra ny 15 minitra, izay kely sy mifantoka be ny fizarana sombina, ary azo hatsaraina ny homogeneity.