Kitapo PCR (MSP) methylation-specipc

Modely A-1

■ Ny môdely dia misy fahalotoana proteinina na mpanakana Taq, sns .——Ataovy ny môdely ADN, esory ny fahalotoan'ny proteinina na esory ny modely ADN miaraka amina kitapo fanadiovana.

■ Tsy feno ny denaturation an'ny môdely —— Ampitomboina araka ny tokony ho izy ny mari-pana amin'ny denaturation ary halavaina ny fotoana maha-denaturation.

■ Fanimbana ny môdely —— Amboary indray ny modely.

A-2 Primer

■ Ratsy kalitaon'ny primera ——Avao-synthesize ny primer.

■ Fanapotehana ny primer ——Aokao ireo primera fitanana avo lenta ho kely kely hitehirizana azy. Sorohy ny hatsiaka be loatra sy ny fanalefaka na 4 ° C maharitra maharitra.

■ Famolavolana primer tsy mety (oh: ny halavan'ny primer tsy ampy, dimer miforona eo anelanelan'ny primers sns.

A-3 Mg²⁺fitanana

■ Mg²⁺ ambany loatra ny fifantohana —— Ampitomboy tsara ny Mg²⁺ fifantohana: Manatsara ny Mg²⁺ fifantohana amina andiana fanehoan-kevitra avy amin'ny 1 mM ka hatramin'ny 3 mM miaraka amin'ny elanelam-potoana 0,5 mM hamaritana ny Mg mety indrindra²⁺ fifantohana isaky ny modely sy ny primer.

A-4 mari-pana amin'ny Annealing

■ Ny mari-pana amin'ny annealing avo dia misy fiatraikany amin'ny famehezana ny primer sy ny modely. ——Ahena ny mari-pana mampifangaro ary manatsara ny toe-javatra amin'ny alàlan'ny gradient 2 ° C.

A-5 Fotoana fanitarana

■ Fotoana fanitarana fohy —— Ampitomboy ny fotoana fanitarana.

Phenomena: ny santionany ratsy dia mampiseho ireo tarika lasibatra kendrena.

A-1 Fandotoana ny PCR

■ Fandotoana ny filaharan'ny tanjona na ny fanamafisana ny vokatra —— Tandremo sao ampifangaroina ny santionany misy ny filaharana kendrena ao amin'ilay santionany ratsy na arotsaka ao anaty fantsona centrifuge. Ny reagents na ny fitaovana dia tokony autoclaved hamongorana ny asidra niokika misy, ary ny fisian'ny fandotoana dia tokony ho faritana amin'ny alàlan'ny fanandramana fanaraha-maso ratsy.

■ Fandotoana reagent ——Aroquot ny reagents ary tahirizo amin'ny hafanana ambany.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ ambany loatra ny fifantohana —— Ampitomboy tsara ny Mg²⁺ fifantohana: Manatsara ny Mg²⁺ fifantohana amina andiana fanehoan-kevitra avy amin'ny 1 mM ka hatramin'ny 3 mM miaraka amin'ny elanelam-potoana 0,5 mM hamaritana ny Mg mety indrindra²⁺ fifantohana isaky ny modely sy ny primer.

■ Famolavolana primer tsy mety, ary ny filaharana kendrena dia misy homolojia miaraka amin'ny filaharana tsy kendrena. —— primera famolavolana indray.

Phenomena: Ny tariby fanamafisana PCR dia tsy mifanaraka amin'ny haben'ny antenaina, na lehibe na kely, na indraindray samy misy tarika fanamafisana manokana sy tarika fanamafisana tsy voafaritra.

Primer A-1

■ Tsy fahaiza-manao voalohany

—— Primera famolavolana indray.

■ Avo loatra ny fatran'ny primer ——Mampiakatra tsara ny mari-pana amin'ny denaturation ary mampaharitra ny fotoana maha-denaturation.

A-2 Mg²⁺ fitanana

■ Ny Mg²⁺ avo loatra ny fifantohana ——Ahenao tsara ny fatran'ny Mg2 +: Manatsara ny Mg²⁺ fifantohana amina andiana fanehoan-kevitra avy amin'ny 1 mM ka hatramin'ny 3 mM miaraka amin'ny elanelam-potoana 0,5 mM hamaritana ny Mg mety indrindra²⁺ fifantohana isaky ny modely sy ny primer.

A-3 Polymerase maharitra

■ Fatra anzima tafahoatra ——Mampihena ny habetsaky ny anzima amin'ny elanelam-potoana 0,5 U.

A-4 mari-pana amin'ny Annealing

■ Ambany loatra ny mari-pana amin'ny rindrambaiko —— Ampitomboy amin'ny tokony ho izy ny mari-pana fampidirana an-trano na ampiharo ny fomba fanaingoana dingana roa

Kitapo PCR A-5

■ Kitapo PCR be loatra ——Mampihena ny isan'ireo tsingerina PCR.

Primer A-1——Miavaka manokana —— Mamolavola indray ny primer, manova ny toerana sy ny halavan'ny primer hanatsarana ny mampiavaka azy; na manao PCR akany.

ADN modely A-2

——Tsy madio ny môdely ——Ataovy ny môdely na esory ny ADN miaraka amin'ny kitapo fanadiovana.

A-3 Mg²⁺ fitanana

——Mg²⁺ avo loatra ny fifantohana ——Ahenao tsara ny Mg²⁺ fifantohana: Manatsara ny Mg²⁺ fifantohana amina andiana fanehoan-kevitra avy amin'ny 1 mM ka hatramin'ny 3 mM miaraka amin'ny elanelam-potoana 0,5 mM hamaritana ny Mg mety indrindra²⁺ fifantohana isaky ny modely sy ny primer.

A-4 dNTP

——Ny haavon'ny dNTP dia avo loatra ——Mampihena araka ny tokony ho izy ny fifantohan'ny dNTP

A-5 mari-pana amin'ny Annealing

——Tena ambany ny mari-pana amin'ny fanaingoana —— Ampitomboy amin'ny tokony ho izy ny mari-pana amin'ny fampidirana annealing

A-6 tsingerina

——Toy ny tsingerina be loatra—— Araraoty ny isan'ny tsingerina

Ny dingana voalohany dia ny mifidy ny polymerase mety. Ny polymerase Taq tsy tapaka dia tsy afaka manamboatra noho ny tsy fisian'ny hetsika exonuclease 3'-5 ', ary ny tsy fitoviana dia hampihena ny fahombiazan'ny sombintsombiny. Noho izany, ny polymerase Taq mahazatra dia tsy afaka manatsara ny sombiny kendrena lehibe kokoa noho ny 5 kb. Taq polymerase miaraka amina fanovana manokana na polymerase fidelity avo lenta hafa dia tokony hofidina hanatsarana ny fahombiazan'ny fanitarana ary hahafeno ny filan'ny fanamafisana sombina lava. Ho fanampin'izany, ny fanamafisana ireo sombintsombiny lava dia mitaky fanitsiana mifanaraka amin'ny famolavolana primer, ny vanim-potoana denaturation, ny fotoana fanitarana, ny buffer pH, sns. Matetika, ny primera misy 18-24 bp dia mety hitarika vokatra tsara kokoa. Mba hisorohana ny fahasimban'ny môdely dia tokony ahena ho 30 seg na latsaka isaky ny tsingerina ny fotoana anaran'ny denaturation, ary ny fotoana hampiakarana ny maripana mankany 94 ° C alohan'ny tokony hampitomboana 1 min. Ankoatr'izay, ny fametrahana ny mari-pana fanitarana eo amin'ny 68 ° C ary ny famolavolana ny fotoana fanitarana arakaraka ny tahan'ny 1 kb / min dia afaka miantoka ny fanamafisana ny sombiny lava.

Ny tahan'ny lesoka amin'ny fanamafisana PCR dia azo ahena amin'ny alàlan'ny fampiasana polymerases ADN isan-karazany miaraka amin'ny fahamendrehana ambony. Anisan'ireo polymerase Taq ADN hita hatreto, ny anzima Pfu dia manana ny tahan'ny lesoka ambany indrindra sy ny fahatokiana avo indrindra (jereo ny tabilao mifatotra). Ankoatry ny fifantina anzima, ny mpikaroka dia afaka mampihena bebe kokoa ny tahan'ny mutation PCR amin'ny alàlan'ny fanatsarana ny fepetra fanehoan-kevitra, ao anatin'izany ny fanamafisana ny fomban'ny buffer, ny fatran'ny polymerase azo hafanaina ary ny fanamafisana ny isa amin'ny tsingerina PCR.